培養(yǎng)基促生長實(shí)驗(yàn)操作

         1  目的 

         制訂培養(yǎng)基靈敏度實(shí)驗(yàn)操作，是為了規(guī)范、統(tǒng)一培養(yǎng)基靈敏度檢測，確保微生物檢測準(zhǔn)確、安全進(jìn)行。 

         2  范圍 

         適用于所有配制好并滅菌的培養(yǎng)基。

         3  編寫依據(jù) 

         EP6.5

         4  術(shù)語 

         無 

         5  職責(zé) 

         QC衛(wèi)檢組人員負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、滅菌、靈敏度實(shí)驗(yàn)。 

         6  內(nèi)容 

         6.1  使用的設(shè)備、器具 

         生物安全柜、無菌培養(yǎng)皿、無菌刻度吸管或無菌注射器、無菌玻璃涂布器、酒精燈等 

         6.2  使用的菌株 

   EP檢測用ATCC的菌株:

    金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus        ATCC 6538

    大腸埃希菌Escherichia coli                 ATCC 8739

    銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa     ATCC 9027       

    枯草芽孢桿菌 Bacilllus subtilis         ATCC 6633

    沙門氏菌Salmonella enterica subsp      ATCC 14028

    白色念珠菌Candida albicans             ATCC 10231

    黑曲霉Aspergillus niger                     ATCC 16404

         培養(yǎng)基靈敏度檢測所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代, 并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)用菌株的生物學(xué)特性。

         6.3  檢測頻率 

         每批配制、滅菌后的培養(yǎng)基均應(yīng)做靈敏度測試。 

         6.4  操作方法

         6.4.1  對照標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基

         用已經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明合格的培養(yǎng)基或購買的有質(zhì)量證書的成品平皿培養(yǎng)基作為對照標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基.

         6.4.2  實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

         將瓊脂類的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)加熱融化后，冷卻至45℃左右，以無菌的方式在無菌培養(yǎng)皿中注入15～20ml，備用。液體類的培養(yǎng)基直接使用。

         6.4.3  菌懸液的制備

         6.4.3.1  細(xì)菌菌懸液的制備

         方法一：取細(xì)菌的斜面培養(yǎng)物1耳匙接種在酪蛋白大豆消化肉湯培養(yǎng)基中30～35℃電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h，取上述培養(yǎng)物用無菌水按10倍系列稀釋，分別制成10-7～10-8的菌懸液備用。 

         6.4.3.2  霉菌菌懸液的制備

         取白色念珠菌的斜面培養(yǎng)物1耳匙接種在沙氏瓊脂斜面上于20～25℃培養(yǎng)24～48h，加入無菌水4ml制成原液，取上述原液按10倍系列稀釋，分別制成10-6～10-7的菌懸液備用。 

         取黑曲霉的斜面培養(yǎng)物加入無菌水4ml制成孢子懸液，取上述孢子懸液按10倍系列稀釋，分別制成10-6～10-7的菌懸液備用。 

         方法二：直接用杭州微球生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品-培養(yǎng)基靈敏度指示劑，該產(chǎn)品已經(jīng)幫我們控制了細(xì)菌數(shù)量，只要直接拿稀釋液稀釋下就可以直接取到10～100CFU試驗(yàn)菌。使用方便，數(shù)量。推薦用此方法操作。

         6.4.4 培養(yǎng)基的生長促進(jìn)實(shí)驗(yàn) 

         6.4.4.1  瓊脂類培養(yǎng)基的生長促進(jìn)實(shí)驗(yàn)   

         每株菌用2個(gè)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基平皿，用表面涂布法在每個(gè)平皿表面接種0.1～0.5ml的菌懸液（約10～100CFU試驗(yàn)菌），同時(shí)用2個(gè)對照標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基平皿做對照，接種相同量的菌懸液試驗(yàn)，在規(guī)定溫度下培養(yǎng),取出平皿點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基上的微生物數(shù)量應(yīng)為對照培養(yǎng)基上微生物生長數(shù)量的70%-150%范圍內(nèi)。

         6.4.4.2  液體類培養(yǎng)基的生長促進(jìn)實(shí)驗(yàn) 

         每株菌用2管（或瓶）實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，接種0.1～0.5ml的菌懸液（約10～100CFU試驗(yàn)菌），同時(shí)用2個(gè)對照標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基或用已知合格的酪蛋白大豆消化瓊脂平皿做對照，接種相同量的菌懸液試驗(yàn)，在規(guī)定溫度下培養(yǎng),對比或計(jì)數(shù)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)能生長菌落為合格。 

         6.4.5  培養(yǎng)基的生長促進(jìn)和抑制特性試驗(yàn) 

         6.4.5.1  液體培養(yǎng)基的生長促進(jìn)特性試驗(yàn) 

         接種0.1～0.5ml的菌懸液（約10～100CFU試驗(yàn)菌）于一定量適合的培養(yǎng)基。在特定溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不超過試驗(yàn)中規(guī)定的MAX短期限。與對照標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基獲得的微生物生長相比，接種微生物的生長應(yīng)明顯。

         6.4.5.2  固體培養(yǎng)基的生長促進(jìn)特性試驗(yàn) 

         采用表面涂布法，在每一塊平皿上接種0.1～0.5ml的菌懸液（約10～100CFU試驗(yàn)菌）適宜微生物。在特定溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不長于試驗(yàn)中規(guī)定的MAX短期限。接種微生物的生長與對照標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基獲得的微生物生長相當(dāng)。 

         6.4.5.3  液體或固體培養(yǎng)基的抑制特性試驗(yàn) 

         用適當(dāng)培養(yǎng)基接種至少100 CFU適宜微生物。在特定溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間至少為試驗(yàn)中規(guī)定的MAX長期限。無受試微生物生長。