大腸桿菌轉(zhuǎn)化實驗

下面喆圖小編為大家介紹使用恒溫培養(yǎng)箱做大腸桿菌轉(zhuǎn)化實驗。

大腸桿菌轉(zhuǎn)化：（1）將重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，增殖和表達(dá)，以獲得目的基因；（2）驗證大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞效果；（3）用于分子生物學(xué)其他研究。 熱擊法：  實驗方法原理：質(zhì)粒DNA或重組DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過42°C短時間的熱擊處理，促進(jìn)吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá)，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。

實驗步驟：

一、實驗材料準(zhǔn)備

1.  器材  旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5 ml 微量離心管，雙面微量離心管架，恒溫水浴鍋，制冰機，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。

2.  試劑  培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無菌ddH2O，IPTG，X-gal。 3.  材料處理  無菌ddH2O，1.5 ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

二、操作步驟

1.  事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。

2.  從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100 μl）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10 min。

3.   加入5 μl 連接好的質(zhì)粒混合液（DNA含量不超過100 ng），輕輕震蕩后放置冰上20 min。

4.  輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5 min。

5.  在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500 μl LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。

6.  在超凈工作臺中取上述轉(zhuǎn)化混合液100-300 μl，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

7.  如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal，8 μl 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

8.  在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。

9.  在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。  10.  觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。

注意事項：1.  玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂。

詳情可咨詢喆圖客服。（恒溫?fù)u床、恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱）